【制藥法規解讀】藥品生產潔凈環境監測要點的研究與分析2024-03
文章在對藥品生產潔凈環境監測相關法規進行分析的基礎上，結合藥品生產企業潔凈環境監測實踐，將藥品生產潔凈環境監測注意點劃分為監測程序規定、監測計劃和監測實施3個方面，進行要點及注意事項的分析與闡述。并通過國內外藥品檢查時在藥品生產潔凈環境方面發現的缺陷進行統計分析，對缺陷分布情況及典型問題進行介紹，為我國藥品生產企業，特別是無菌藥品生產企業，進一步做好藥品生產潔凈環境監測提供參考與借鑒，同時也為各類藥品生產潔凈環境監測的檢查提供思路。
藥品完成內包裝前的潔凈環境控制良好，可有效避免藥品受到微生物和微粒等外來污染。2013 至2019 年，全球因微生物污染及無菌保證缺乏等因素召回的藥品占召回藥品總量的40.26％?[1]。因此，做好藥品生產潔凈環境監測對保證藥品質量有重要意義。
潔凈環境監測是制藥企業污染控制的重要組成部分，主要用于評估藥品生產中微生物控制的有效性，特別是無菌藥品。近年的國內外藥品檢查中發現，藥品生產企業潔凈環境監測仍存在問題，潔凈環境監測實踐方面仍有不足。因此，有必要就如何有效開展藥品生產潔凈環境監測，進行系統分析與要點研究。
國內外GMP 對于藥品生產環境監測均有明確規定，盡管其中對于潔凈級別的分類存在微小差異，但總體原則與要求是相似的。我國GMP 附錄《無菌藥品》中將潔凈級別分為A 級、B 級、C 級和D 級，并與國際標準化組織(ISO) 的潔凈室及相關控制環境系列標準(ISO 14644) 進行了關聯；同時GMP正文中明確，非無菌制劑生產的暴露工序區域應當參照《無菌藥品》中D 級潔凈區的要求設置，企業可根據產品的標準和特性對該區域采取適當的微生物監控措施[2]。歐盟新修訂的GMP 附錄《無菌藥品生產》中也明確，潔凈室和潔凈空氣設備的確認可參考ISO 14644 系列標準[3]。WHO 和美國FDA關于無菌藥品生產的技術標準與指南中均有類似的描述[4-5]。
各國GMP 均以ISO 14644 系列標準為基礎，結合藥品生產特性，將藥品生產環境分類為4 個不同等級。其中，除塵埃粒子外，增加了微生物標準(包括浮游菌、沉降菌和表面微生物)，并要求基于設施設備、生產工藝與步驟、操作、確認數據及歷史監控數據等的風險評估，制定全面的環境監測計劃與程序(包括取樣位置、監測頻率、監測方法、行動限與警戒限、趨勢分析方法、異常情況調查與糾正措施等)，以保證潔凈室和潔凈空氣設備能持續提供符合設計和法規要求的適宜空氣，并及時發現異常和偏離環境限度的情況。
除GMP 規定外，《中華人民共和國藥典》2020年版(ChP 2020)、《美國藥典》(USP 2022) 及《WHO藥品微生物實驗室管理規范》(2011 版) 中對潔凈環境監測也有相關規定。其中，《WHO 藥品微生物實驗室管理規范》要求基于風險評估結果制定環境監測計劃[6]；而ChP 2020 和USP 2022 針對不同潔凈級別均明確了指導性監測頻次，但二者適用范圍并不相同，監測頻次的差異也較大。《美國注射劑協會技術報告》中的環境監測計劃基本原則認為，環境監測屬于污染控制策略的一部分，適用于評估無菌藥品生產中微生物控制的手段[7]。從執行角度來看，環境監測本身也是一種干預行為，并非越多越好，關鍵在于基于風險評估結果，確保監測行為科學、合規、有效。
在探討藥品生產潔凈環境監測要點前，需要明確藥品生產潔凈環境監測不是一項孤立的工作，有著必要的前提條件，包括有相應資質的人員、合理的廠房設施設計與維護、適宜的清潔與消毒程序、可靠的工藝控制，以及有效的質量管理體系。本研究主要著眼于暖通空調系統(heating，ventilation and air-conditioning systems，HVAC) 及潔凈區已完成設計、安裝、運行及性能確認后，在常規生產期間的潔凈環境監測要點(圖1)。
藥品生產潔凈環境監測要點圖
質量風險管理貫穿藥品生產潔凈環境監測的全過程，數據可靠性是藥品生產潔凈環境監測的基礎；環境監測計劃的制定需要基于風險評估，環境監測的實施必須保證數據可靠性。根據藥品生產潔凈環境監測開展的不同階段與邏輯，可從環境監測程序規定、監測計劃和監測實施3個方面進行分析。
環境監測程序是整個藥品生產潔凈環境監測工作開展的依據與指導文件，應明確不同潔凈級別環境監測的基本標準與要求，包括：溫度、相對濕度、壓差、懸浮粒子與微生物等；同時需要明確環境監測計劃制定的原則與程序、懸浮粒子及微生物監測標準操作規程、趨勢分析方法與要求、異常情況處理程序、記錄與定期分析報告要求等。
溫度、相對濕度、壓差應采取適宜的方式監測。對于壓差梯度是關鍵性影響因素的房間(如人流與物料的緩沖間、氣鎖間)，需要考慮進行持續在線監測，并考慮人員現場進入房間前確認的方式。懸浮粒子監測標準程序中需重點關注采樣管長度、彎管半徑及采樣體積。微生物監測標準程序需注意浮游菌采樣法、沉降菌法、表面取樣法的細節操作，如平皿蓋擺放、平皿編號原則與方式、沉降菌實際采樣時間的折算要求、培養方式與條件、微生物觀察與記錄要求、擦拭取樣面積的保障等。趨勢分析及異常情況處理程序中需關注警戒限與行動限的建立原則、定期(如每季度或每年) 數據趨勢分析的要求、趨勢分析中的判異原則、出現異常趨勢時的調查要求、難以去除微生物(如細菌芽孢或霉菌)的特殊處理程序等。
潔凈區環境監測計劃應基于全面的風險評估制定，包括對實際生產設施設備、生產工藝與步驟、涉及操作、HVAC 系統確認期間的數據及歷史監控數據等的全面評估。風險評估的重點包括：確定懸浮粒子和微生物監測的取樣位置、監測點數量、監測項目、監測或取樣方法、監測時間、監測頻率，以及明確的行動限與警戒限等內容，并應形成質量風險評估報告。
取樣位置的選擇需考慮房間布局、生產工藝和網格化設計[8]，關注可能導致產品污染的位置與工藝、可能發現微生物污染的位置、難接近和消毒的位置，以及必要的輪換或隨機取樣位置。監測點數量通常取決于該區域的潔凈級別、開展的工作、物料和人員流向、操作情況、區域面積等因素。以無菌藥品生產的A 級區為例，常見的關鍵監測位置包括灌裝線開關、灌裝容器附近以及關鍵設備表面(如敞口小瓶轉盤、灌裝位置、膠塞料斗、灌裝針、操作手套等)。監測項目與監測或取樣方法主要是指對懸浮粒子與微生物的監測要求，A 級區對懸浮粒子的要求最高，需要全過程監測，B 級區可以采用略低的監測頻率。對于微生物的監測，通常要采用多種方法。對A 級區的關鍵操作全過程要進行浮游菌和(或) 沉降菌監測；在生產結束后，A 級區與B 級關鍵區域都需要進行表面微生物監測[如灌裝線、控制面板、膠塞料斗、灌裝針、門把手、墻壁、限制進出屏障系統（restricted access barrier system，RABS）門及操作手套、隔離簾等]。
值得注意的是，監測或取樣方法的有效性需在風險評估中進行論證。在監測時間與監測頻率方面，GMP 在無菌藥品生產章節對部分關鍵區域的監測時間與頻率進行了規定，如：A 級區關鍵操作的全過程(含設備組裝階段)，基本要求是應能發現潛在的系統問題及對產品的潛在污染風險。在制定時應考慮法規規定、產品類型與生產工藝、人員操作與干預、產品后期是否滅菌、歷史監測數據、季節引起的微生物變化(如梅雨季節的霉菌、特定區域不同月份微生物的增長趨勢差異[9]) 等因素。注意考慮在生產過程中對關鍵區域進行監控是否會增加產品污染的可能性；如果可能存在此風險，應在操作完成后進行取樣。此外，如果生產過程中污染的可能性很低(如密閉系統生產)，則可以考慮降低監測頻次。對于行動限與警戒限：通常行動限是基于法規或行業指南建立的；而警戒限則是基于對環境監測歷史數據的分析結果建立的，常見的建立方法包括閾值法、正態分布法(盡管環境監測數據往往不屬于正態分布) 和公差限值法。在監測計劃制定時，應注意無菌隔離系統的特殊性，其風險與常規的無菌生產環節不同，需要更多關注破損或泄露導致的污染。
環境監測計劃制定后，需要按照環境監測程序文件規定和計劃對藥品生產潔凈環境實施監測，此環節需重點關注數據的可靠性。實施環節的取樣操作應嚴格按程序規定開展，避免任何可能影響監測結果的操作(如取樣時間不足、消毒劑與培養基接觸等) ；使用經校準或確認后符合要求的監測設備；確保微生物監測用培養基的靈敏度，在規定條件下采用適宜的方式進行培養(一般考慮在20 ～ 25 ℃培養3 d 后，繼續在30 ～ 35 ℃培養2 d)，在培養過程中及結束時計數，并對A 級區和B 級區檢出的微生物進行鑒定，必要時對超出限度標準的C 級區與D 級區微生物進行分離鑒定。對于出現超出限度規定的結果與異常趨勢，均需按程序規定進行調查，必要時采取糾正和預防措施。所有監測與調查操作需要進行記錄，并保證記錄符合ALCOA+ 原則(即可追溯、清晰、同步、原始、準確、完整、一致、持久與可獲得)[10]，例如環境微生物監測記錄信息至少應包括監測日期與時間、取樣位置、取樣方法、培養基名稱與批號、培養條件、培養時間、微生物監測結果(菌落單位)、取樣及檢測人員等，并注意采樣后培養基平皿標識與實際記錄的關聯。最終按程序對環境監測數據進行收集、分析，形成階段性監測報告。
對2019 至2022 年我國國家藥品監督管理局、美國FDA、歐洲藥品質量管理局及WHO，在全球藥品生產企業檢查中針對藥品生產潔凈環境監測提出的部分缺陷進行了收集與整理，通過對近300 個環境監測相關缺陷的統計分析，基于上述潔凈環境監測要點分類，歸納出當前藥品生產企業在環境監測方面的常見問題分布(圖2)。
藥品生產潔凈環境監測相關的常見缺陷分布主要是3 個方面：環境監測程序規定(12％)，環境監測計劃(56％) 和環境監測實施(32％)，其中占比較高的問題依次是取樣位置(19.6％)、監測報告(9.5％)、基于風險評估的監測計劃制定(9.1％)、監測時間和頻次(8％)、限度標準(7.7％)、監測項目(7.3％)、培養基(6.6％)、異常情況識別與調查處理(5.9％)、基本要求(4.6％)、趨勢分析方法(2.8％) 和取樣操作(2.8％)，上述缺陷項目總和占全部的80％以上。
潔凈區內溫度、相對濕度和壓差是監測的基礎指標，典型問題有以下幾種。(1) 程序中對“關鍵性”與“非關鍵性”房間采取不同的監測要求，但二者的定義與區分不明確；(2) 關鍵生產區域未進行特定指標的監測，或監測方式存在潛在風險(如缺少持續監測或報警系統、現場人員不能確認區域狀態、限度標準范圍不合理等)；(3) 生產現場溫度、相對濕度或壓差超出標準規定。
趨勢分析方法方面主要有以下典型問題。(1)未規定如何報告、展現、分析和執行環境監測的趨勢分析；(2) 相關程序規定不詳細、不清晰。
監測標準操作規程和異常程序處理規程中存在部分規定不明確或不合理的情況。(1) 規定沉降菌結果采用平均值與標準限度進行對比，存在潛在污染風險批次放行的可能；(2) 缺少詳細說明環境監測異常時的處理、記錄與調查要求的程序規定。
此外，還存在監測計劃的制定程序缺少對較低級別區域監測的考慮、環境監測操作的監督，以及潛在風險評估不足等問題。
潔凈區環境監測計劃中，取樣位置、監測項目與監測點數量是相互關聯的，具體如下。
首先，取樣位置的問題主要是未對關鍵風險區域進行取樣監測，以及現有取樣位置不具有代表性，典型問題如下。(1) 無菌連接處、延展層流下方、加塞后的傳輸軌道等位置，未設置取樣點；B 級區的生產培養室未進行取樣監測；監測位置遠離無菌操作或人員干預區域；環境監測風險評估文件中未明確具體的取樣位置。(2) 懸浮粒子監測中，與A級區直接相連的B 級區房間未進行監測；隧道烘箱出口處的小瓶轉盤、膠塞料斗、隧道烘箱冷卻段等位置，未設置監測點；懸浮粒子采樣器位置不合理，如正對著玻璃門、安裝位置高于凍干機門等。(3)表面微生物監測中，A 級區人員操作手套手指(包括RABS 上的手套)、灌裝區域人員和物料頻繁接觸的表面(包括延展層流的塑料簾、RABS 門內外表面、B 級區操作面板、膠塞料斗、灌裝針頭等)、無菌操作人員侵入灌裝線、分裝線靠墻的位置與墻壁等位置未進行監測；僅針對固定位置進行監測，未采用表面擦拭法隨機檢查難以清潔的點；B 級區地面未進行表面微生物監測；原液車間C 級區，僅要求對設備面板和層流罩保護簾外表面進行微生物監測。
其次，監測項目的問題主要是僅對一些關鍵性區域進行了監測，典型問題如下。(1)A 級區小瓶緩沖區域、凍干機裝置位置等未進行浮游菌監測；(2)A 級區加塞位置缺少懸浮粒子監測或微生物監測；(3)B 級區更衣室及灌裝間未進行表面微生物監測；(4) 生產培養室未進行沉降菌監測；(5)C 級區均未進行表面微生物監測；(6)D 級區未監測懸浮粒子；(7) 未設置在線懸浮粒子監測。
另外，監測點數量方面的問題主要是潔凈區內監測點數量過少，與生產操作和潔凈區面積等不匹配，典型問題如下。(1)B 級區只有1 個懸浮粒子采樣點；(2) 生產線有16 個灌裝針頭且覆蓋了較長的表面，但灌裝位置只有1 個采樣點。
風險評估計劃制定相關問題的頻次居于環境監測計劃方面的第二，典型問題如下。環境監測計劃標準作業程序(SOP) 中無正式的風險評估報告，包括取樣位置、取樣頻次等均未基于正式的風險評估開展，例如層流設備A 下的懸浮粒子監測點的設置未基于風險評估，2 個監測點高于操作水平面并靠墻安裝。
監測時間與頻次方面的問題主要是環境監測頻次過低，以及監測期間未能覆蓋關鍵操作區間，典型問題如下。(1) 無菌操作最開始，即分裝器具組裝時未進行環境監測；(2) 培養基模擬灌裝試驗中，微生物環境監測未覆蓋物料轉入RABS 的過程；(3)灌裝線組裝結束后，未進行浮游菌及表面微生物監測；(4) 原液配制過程中未進行浮游菌監測，而是在人工無菌操作開始前進行監測；(5) 浮游菌檢測僅在生產活動結束后進行；(6)B 級區的微生物監測頻次未考慮操作的差異性，統一規定每3 個月進行1 次( 包括對涉及人員操作的無菌灌裝間) ；(7)上游無菌生產工藝的常規環境監測(包括微生物)每周僅進行1 次；(8) 對灌裝線B 級區和C 級區的表面微生物(如設備面板、門把手和工作臺表面)，僅在性能確認時進行監測；(9) 規定所有C 級區、D 級區，每年僅進行1 次環境監測；(10)B 級灌裝間未規定浮游菌取樣監測的具體時間要求；(11) 分裝過程中，未連續監測干熱滅菌柜和手套箱之間的A 級層流罩的懸浮粒子。
限度標準方面的主要問題集中在環境監測警戒限和行動限制定不合理，以及對個別區域環境標準適用不當，典型問題如下。(1) 未制定環境監測的警戒限和行動限；(2) 未基于歷史數據制定環境監測的警戒限和行動限；(3) 制定的警戒限與行動限僅適用于動態條件，未制定靜態監測的警戒限與行動限；(4) 對于懸浮粒子的報警限度，未考慮超過5 μm 粒子的連續低計數情況；(5) 僅針對固定采樣點制定了懸浮粒子的警戒限，未對B 級區的移動計數器采樣點設置警戒限；(6) 對于緊鄰A 級區RABS 層流的延展層流區域(其下人員會打開RABS 門進行個別干預操作) 的微生物限度采用B級標準，未能基于工藝、環境和產品的潛在風險進行充分評估。
監測方法的問題主要涉及空氣采樣量和表面擦拭取樣方法2 個方面，典型問題如下。(1) 對于表面微生物，未建立針對不規則表面的擦拭取樣方法，或未建立并確認擦拭取樣面積的方法；(2) 環境監測方案中未補充用于檢測特定微生物(產多糖細菌) 存在的方法；(3) 凍干機開門處空氣采樣量均為1 m3，未考慮凍干機門打開時間延長或者操作員靠近凍干機開門的時間。
潔凈環境監測在實施階段存在的問題，從發生頻次的高低來看，依次為監測報告、培養基、異常情況識別與調查處理、取樣操作、監測記錄、微生物培養與計數、監測設備、菌落鑒定等方面。
監測報告的問題集中在未能對環境監測數據開展有效的趨勢分析，典型問題如下。(1) 企業未能提供環境監測報告及趨勢分析。(2) 缺少環境監測部分項目(如灌裝線A 級區的懸浮粒子、人員表面微生物等) 的趨勢分析。(3) 趨勢分析不充分，未考慮同一位置重復發現微生物的情況；每年僅進行1 次環境監測趨勢分析，不利于及時發現并識別無菌區的潛在偏移。(4) 趨勢分析中僅限于將結果與標準進行比較，而未其轉化為信息，并調查根本原因。
培養基相關的問題主要包括表面接觸平皿中和劑的添加、培養基促生長試驗及自制培養基的包裝這3 個方面，典型問題如下。(1) 表面監測用培養基成分中未包括任何中和劑，未評估設備及潔凈服表面殘留消毒劑的影響；(2) 培養基促生長試驗存在不足，如未對環境監測培養基進行促生長試驗、未使用企業實際環境中的典型菌、僅使用了金黃色葡萄球菌1 種代表菌等，或未對暴露4 h 的沉降菌監測用培養基進行促生長試驗；(3) 自制培養基的包裝方式難以保證轉入A 級區后的表面無菌；(4)未對進行了接觸平皿采樣后的表面清潔與消毒情況進行研究。
異常情況識別與調查處理方面的問題主要是對環境監測中的異常趨勢未能進行有效識別、分析、調查與處理，典型問題如下。(1) 對操縱環境監測數據的情況，未啟動任何偏差調查；(2) 針對環境監測異常的根本原因分析不合理，且未進行記錄；(3) 針對B 級區發現的2 次芽孢桿菌，未按其程序規定啟動偏差調查；(4) 預充式灌裝線B 級區生產期間多次發現芽孢桿菌，但由于未超過警戒限，僅對其進行了鑒定，未采取其他針對性的消毒措施；(5)A 級區、C 級區的多個環境監測平皿超出了行動限，但未啟動調查。
取樣操作存在不規范的行為，典型問題如下。(1) 操作人員未按程序規定進行環境監測取樣；(2)沉降菌取樣時平皿蓋遮擋了部分平皿暴露區域；(3)操作人員使用噴壺噴灑手臂消毒液時，緊鄰沉降菌監測平皿且噴灑方向朝向平皿；(4) 擦拭法取樣時，未使用面積模具，難以保證有效的取樣面積。
監測記錄的問題主要是記錄信息不完整、不同步、不真實等，典型問題如下。(1) 存在操縱環境監測結果記錄的情況；(2) 環境監測樣品未標記采樣日期和時間，監控顯示樣品實際采樣時間與批記錄存在差異；(3) 環境監測記錄中未記錄懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的具體監測時間；(4) 監控顯示，操作人員未按程序規定進行表面微生物監測，但記錄中卻顯示了對應項目的監測。
微生物培養與計數方面的問題主要涉及操作的規范性，典型問題如下。(1) 培養平皿計數僅用人工肉眼計數，難以保證對細小菌落的有效識別；(2)未對培養基平皿觀察計數情況進行復核；(3) 對沉降菌監測平皿計數結果的折算方式不合理；(4) 企業規定在30 ～ 35 ℃培養至第5 天時觀察結果，進行培養基促生長試驗時真菌是在20 ～ 25 ℃培養，未評估30 ～ 35 ℃對真菌監測結果的影響；(5) 在使用封口膜密封平皿、采用多層塑料袋對培養基平皿裝袋等方式的狀態下進行培養，未評估該操作可能對需氧菌生長產生的影響；(6) 缺少培養期間的計數觀察與記錄。
監測設備的問題主要集中于懸浮粒子監測儀，如對懸浮粒子監測儀前部管道的半徑與形狀未作要求，現場發現個別管道較長，且呈U 形，導致無法有效監測實際懸浮粒子數量；又如，采用同一個便攜式懸浮粒子計數器，對陽性區域和非陽性區域進行環境監測，存在交叉污染風險。
菌落鑒定方面的問題主要是未對A 級區、B 級區環境監測中發現的微生物進行鑒定。
藥品生產潔凈環境監測是藥品生產污染控制策略的重要組成部分[11]，顯示出藥品生產企業在無菌保證、質量風險管理、統計分析等方面的能力，也體現了企業對其藥品生產工藝與步驟、廠房設施與設備、清潔與消毒等方面潛在風險情況的理解程度，是無菌藥品檢查的關鍵內容[12]。特別是對于參數放行的無菌藥品，潔凈環境監測更是影響藥品能否放行上市的直接因素之一[13]。
藥品生產企業(特別是無菌藥品生產企業) 必須高度重視潔凈環境監測。本研究對藥品生產潔凈環境監測各階段的要點進行了探討，并對近年來國內外檢查中針對潔凈環境監測各方面的典型問題進行了分析與舉例，內容涵蓋藥品生產潔凈環境監測的核心內容。藥品生產企業可以借鑒本研究的相關內容，結合實際情況，對潔凈環境監測工作進行全面評估，進一步完善相關措施，確保對潔凈環境監測的有效性與適宜性，進而更好地保證藥品質量。
在各類藥品檢查(包括企業自檢與外部審計)中，可以將藥品生產潔凈環境監測質量風險評估報告作為切入點，結合企業現場廠房設施與設備布局、生產工藝與實際操作等，評估生產潔凈環境監測計劃的合理性，并對相關程序規定與環境監測實施情況進行抽查。參考本研究列舉的要點與典型問題，可進一步提高檢查工作的有效性。
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